В клинике Института мозга человека РАН было обследовано 54 пациента с рассеянным склерозом (37 женщин и 17 мужчин) в возрасте от 14 до 52 лет (табл. 1). Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1.
| пол | возраст (г.) | |||||
| 14-25 | 26-35 | 36-45 | >46 | всего | % | |
| мужчины | 3 | 4 | 9 | 1 | 17 | 31,5 | женщины | 7 | 10 | 14 | 6 | 37 | 68,5 |
| итого | 10 | 14 | 23 | 7 | 54 | 100 |
Как видно из таблицы, рассеянным склерозом страдали преимущественно люди молодого, трудоспособного возраста (37человек), что составило 68,5%, чаще женщины (37 человек, 68,5%). Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 2. Длительность заболевания составила от 1 до 12 лет. Все больные находились в стадии ремиссии. Степень инвалидизации по расширенной шкале инвалидизации (EDSS) составила от 0 до 6,5 баллов. Всем пациентам с рассеянным склерозом были выполнены различные клинико-диагностические исследования. Данные об объёме этих исследований приведены в таблице 2.
| название метода исследования | количество исследований | |
| абс. | % | |
| Иммунологическое исследование крови: | ||
| иммунофлюоресцентный метод определения субпопуляций Т- и В-лимфоцитов с помощью наборов моноклональных антител CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ (Барышников А.Ю., 1990); | 54 | 100 |
| метод определения функциональной активности нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест); | 54 | 100 |
| микрометод теста торможения адгезии лейкоцитов в присутствии нейроспецифических антигенов – белка S-100 и антигена нейрональных мембран, основного белка миелина и галактоцереброзидов-С I типа (Фригмель Г., 1987); | 54 | 100 |
| метод иммуноферментного анализа для определения уровней иммуноглобулинов классов A, G, M. | 54 | 100 |
| метод иммуноферментного анализа для определения содержания провоспалительных (ФНО-а, ИФН-г, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов в сыворотке крови. | 54 | 100 |
| Магнитно-резонансная томография | 54 | 100 |
Обследование больных с целью диагностики рассеянного склероза включало в себя клинические, лабораторные и лучевые методы диагностики. Исследование неврологического статуса включало изучение медицинской документации для установления частоты перенесённых обострений, а также длительности заболевания и оценку тяжести состояния больных с помощью шкал инвалидизации по J. Kurtzke (1983): Disability Status Scale (DSS) и Expanded Disability Status Scale (EDSS).
| DSS | EDSS | ||
| 0 | симптомов нет | ||
| 1 | только микросимптомы (пирамидные знаки или снижение вибрационной чувствительности) | 1.0 – нет нарушений | |
| 1.5 – нет нарушений | |||
| 2 | небольшая слабость, слабо выраженные нарушения походки, сенсорные или глазодвигательные нарушения | 2.0 – амбулаторный больной | |
| 2.5 - амбулаторный больной | |||
| 3 | умеренно выраженная слабость или монопарез, атаксия, либо их комбинация | 3.0 – умеренные нарушения | |
| 3.5 - умеренные нарушения, амбулаторный больной | |||
| 4 | относительно выраженная слабость, до 12 часов в день может находиться в вертикальном положении, себя обслуживает полностью | 4.0 – как в DSS, больной себя обслуживает, может пройти без помощи и отдыха 500м. | |
| 4.5 – требуется минимальная помощь, может работать полный день, пройти без помощи и отдыха 300м. | |||
| 5 | самостоятельная ходьба на небольшие расстояния, неполный рабочий день | 5.0 - может пройти без помощи и отдыха 200м., неполный рабочий день | |
| 5.5 - может пройти без помощи и отдыха 100м., неполный рабочий день | |||
| 6 | ходьба только при поддержке | 6.0 – односторонняя поддержка при ходьбе на расстояние 100м. | |
| 6.5 – постоянная поддержка с 2-х сторон для ходьбы на 20м. без отдыха | |||
| 7 | активность в пределах кресла-коляски, сам в ней передвигается, садится | 7.0 – может передвигаться в кресле-коляске весь день | |
| 7.5 – необходима помощь при передвижении в кресле-коляске, не может быть в ней весь день | |||
| 8 | ограничен кроватью или креслом, себя обслуживает с помощью рук | 8.0 - как в DSS | |
| 8.5 – эффективно использует руки, но трудности в самообслуживании | |||
| 9 | полностью прикован к постели и беспомощен | 9.0 – прикован к постели. возможно общение и еда | |
| 9.5 – беспомощен, не может говорить, есть, глотать | |||
В клинике исследование состояния иммунной системы осуществлено у всех пациентов РС в стадии ремиссии. Объектом исследования служила периферическая гепаринизированная (25 ЕД/мл) кровь.
Для получения информации о состоянии иммунной системы были использованы следующие методы:
Лимфоциты, выделенные в градиенте плотности фиколл-верографина в концентрации 4-6х106 мл, инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 минут при комнатной темпиратуре, затем отмывали 1 мл физраствора центрифугированием при 1200 об/мин в течение 2 минут, после чего клетки инкубировали с 20 мкл F (ab) 2 фрагментов антисыворотки против глобулинов мыши, меченных ФИТЦ в течение 30 минут при t °C, после чего клетки дважды отмывались 1 мл физраствора и ресуспензировались в 50 мкл физраствора; следующим этапом являлось перемещение клеток на предметное стекло с лунками из парафильма, покрытое полилизином, и их инкубация в течение 20 минут при комнатной температуре; после чего физраствор из лунок предметного стекла отсасывали, в лунки вносили 20 мкл 50% глицерина на физрастворе; реакцию учитывали в течение 24 часов на микроскопе Люмам-ИЗ (Россия) с объективом 90х и окуляром 10х.
Количество субпопуляций лимфоцитов выражали в процентах.
Постановку метода осуществляли с использованием периферической цельной крови человека. Каплю крови на предметном стекле смешивали с раствором нитросинего тетразолия (Sigma, США), инкубировали при 37° в течение 30 минут. Определяли уровень спонтанного (базального) и стимулированного продигиозаном (0,2 мг на 1 мл фосфатного 0,15М буфера) НСТ. Затем в предварительно окрашенном мазке просчитывали количество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана. Подсчёт клеток осуществляли в микроскопе «Эргавал» (Германия) с увеличением 10х100.
Рассчитывали резервный коэффициент (РК) как отношение показателя стимулированного НСТ-теста к базальному.
В лунки стрипов вносили по 100 мкл активирующего раствора и инкубировали 30 минут при 37°С, после чего промывали. Затем в лунки первых двух стрипов вносили по 100 мкл калибровочных проб, а в остальные лунки по 100 мкл анализируемых образцов и инкубировали 45 мин. при 37°С, после чего снова промывали. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора конъюгата и инкубировали 30 мин. при 37°С, по окончании инкубации – промывали. Затем во все лунки стрипов вносили по 100 мкл раствора ОФД и инкубировали 25-30 мин. при комнатной температуре. Остановку реакции осуществляли добавлением 50 мкл стоп-реагента на каждую лунку.
Результаты анализа регистрировали фотометрически при длине волны 492 нм. По результатам измерения строили калибровочный график и определяли концентрацию иммуноглобулина.
Для ИФА использовали наборы ЗАО «Вектор-Бест»:
В лунки 60-луночного микропланшета фирмы «Медполимер» (Россия) вносили по 0,02 мл взвеси из пробирок, содержащих предварительно внесённые 0,5 мл среды 199 с 10% телячьей сывороткой и 0,1 мл раствора нейроспецифического антигена и 0,02 мл плазмы периферической гепаринизированной крови человека. Реакция ставилась в триплетах. В контрольных лунках раствор антигена заменялся соответствующим количеством среды.
Планшеты инкубировали в эксикаторе при 37° с 5% СО2 в течение 3 часов, после чего планшеты переворачивали и помещали в эксикаторе в холодильник при t +4-6°С на 24 часа.
Затем жидкость удаляли из планшетов вытряхиванием, а количество адгезированных клеток подсчитывали на микроскопе фирмы «Карл-Цейс-Йена» (Германия).
Рассчитывали индекс адгезии (ИА) как отношение среднего числа прилипших клеток в опытных лунках (содержащих раствор нейроспецифического антигена) к таковому в контрольных лунках. Индекс менее 0,7 расценивался как положительная реакция. В РТАЛ использовались следующие нейроспецифические антигены;
Для определения цитокинов использовались отечественные тест-системы, разработанные в ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург) и производимые фирмами «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург) для цитокинов: ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-альфа и ТОО «Цитокин» для ИФН-гамма. Тест-системы основаны на «сэндвич» – методе твёрдофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.
Первые моноклональные антитела (МКАТ) предварительно иммобилизовали на внутренних поверхностях ячеек твёрдых планшетов для ИФА. В первые два вертикальные ряда ячеек планшета вносили по 100мкл стандартов: А - 0 пг/мл исследуемого цитокина, В – 50 пг/мл, С – 250 пг/мл, D – 500 пг/мл, Е – 1000 пг/мл, F – 2000 пг/мл цитокина.В остальные ячейки вносили по 100 мкл образцов. Образцы и стандарты вносили в рекомендуемых буферах. Планшет инкубировали в течение 1,5 часов при 18-20° С. После инкубации раствор из ячеек удаляли с помощью пипетки. Затем ячейки трижды промывали внесением 300 мкл промывочного раствора в каждую из них. Остатки промывочного раствора удаляли с помощью пипетки. Вторые МКАТ, меченые биотином, вносили по 100 мкл и инкубировали образцы с ними в течение 1,5 часов при непрерывном встряхивании при +18° С. После инкубации раствор из ячеек удаляли с помощью пипетки. Ячейки трижды промывали внесением 300 мкл промывочного раствора в каждую из них. Остатки промывочного раствора удаляли. Конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена, разбавленный 1:100 буфером, вносили по 100 мкл во все ячейки планшеты и инкубировали при 18° С и непрерывном встряхивании в течение часа. После инкубации раствор из ячеек удаляли. За 10-15 минут до окончания икубации готовили раствор субстрат-хромогенной смеси. Ячейки планшета, после удаления раствора, трижды промывали внесением 300 мкл промывочного раствора в кажую из них и 3-5 раз дистиллированной водой с последующим удалением её встряхиванием планшета над раковиной. Во все лунки добавляли по 200 мкл раствора субстрат-хромогенной смеси. Инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Останавливали реакцию добавлением 50 мкл раствора 1N серной кислоты. Учёт результатов, определяющих активность связанной пероксидазы, проводили с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 492 нм, устанавливая нулевое поглощение по лункам со стандартом без определяемого цитокина в растворе. Количественную оценку результатов проводили методом построения калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации антитела. чувствительность метода при использовании отечественных тест-систем – 5 – 30 пг/мл.
Группу контроля при исследовании иммунологических показателей составили 30 практически здоровых лиц. У этих же волонтёров были изучены варианты объёмов головного мозга.
При исследовании больных с целью первичной диагностики или подтверждения диагноза рассеянного склероза был использован высокоинформативный метод лучевого исследования – магнитно-резонансная томография (МРТ).
Магнитно-резонансную томографию выполняли на базе Центрального Научно-Исследовательского Рентгенорадиологического Института (ЦНИРРИ) на аппарате Magnetom Vision c напряжённостью 1,5Тл (фирма “Siemens”) с использованием градиентной катушки “Head”.
Томограммы срезов головного мозга получали в аксиальной, сагиттальной и фронтальной плоскостях, с получением Т1 и Т2-взвешенных изображений и изображений, взвешенных по протонной плотности. Для более точного подсчёта очагов демиелинизации использовали инверсию восстановления. Объём и параметры проводимого исследования в каждом конкретном случае зависели от состояния больного, анатомической области и задач исследования.
При исследовании больной находился в горизонтальном положении на спине. Голова фиксировалась в катушке на уровне 1см. выше бровей.
Т1 взвешенные изображения использовали для определения правильности укладки головы пациента относительно центра магнита и выбора зоны томографии. Для этого получали ориентировочные срезы через центральные структуры мозга в сагиттальной и аксиальной (трансверзальной) проекциях. Количество срезов составляло 23, толщина среза 5 мм, время получения срезов 7 сек. Правильность укладки головы пациента проверяли по анатомическим соотношениям структур головного мозга на срединном срезе в сагиттальной проекции.
Затем использовали Т2 взвешенные изображения и изображения взвешенные по протонной плотности для визуализации очагов рассеянного склероза как в аксиальной, так и в сагиттальной проекциях, дополняя их изображением головного мозга, полученным в корональной проекции. Параметры составляли: TR/TE 2200/20 и 80 мс, при поле зрения 60%, числа повторений –1 и количестве срезов – 23, время сканирования – 9 секунд. Сравнение изображений в двух или трёх проекциях позволяло выявить даже небольшие очаги демиелинизации. Последовательность инверсии восстановления (IR) применялась для выявления очагов рассеянного склероза, расположенных в стенках боковых желудочков или не визуализирующихся на фоне СМЖ. Параметры исследования были стандартизированы у всех пациентов и составляли: ТК (время повторения) –1500мс, ТЕ (время эха) – 20-80мс, числа повторений – 1.
Томограммы, сделанные в этих режимах, позволяли определить бляшки рассеянного склероза во всех сложных случаях, в том числе на фоне спиномозговой жидкости, за счёт удаления объёмного усреднения сигнала между СМЖ и бляшками. Бляшки рассеянного склероза при этой методике выглядели как гиперинтенсивные участки, а СМЖ имела гипоинтенсивный сигнал.
Использование методики МРТ головного мозга и оценка её в свете клинических и иммунологических данных позволили объективно оценить особенности проявления рассеянного склероза.
Полученные данные были подвергнуты статистическому анализу по общепринятым методам и по полуавтоматическому методу для подсчёта количества и объёма очагов демиелинизации с использованием компьютерной программы Java Jmage (“Xinapse Systems”, Англия). Для этого томограммы срезов головного мозга копировали в программу Java Jmage. Курсором обозначали границы очага поражения, подсчёт объёма которого в дальнейшем происходил автоматически.
Определение различий основывалось на t – критерии Стьюдента и по программе «Статистика».
